转膜三明治顺序

一、蛋白提取

组织样蛋白提取方法（需要准备的试剂和仪器：ripa裂解液、PBS溶液、组织样本、匀浆器或研磨仪、离心机、超声仪破碎、冰盒）

1、用灭菌的工具分离新鲜的组织50mg-100mg，并预冷的生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪成可放入2ml离心管的小块。

2、将组织放入匀浆器或研磨仪中，加入适量的含有蛋白酶抑制剂（必要时需加入磷酸酶抑制剂）的ripa裂解液（每20mg中加入150-250ul裂解液），置于冰上研磨2-5min，直到无肉眼可见的团块，冰浴裂解30min，让组织细胞充分裂解。

3、超声处理10-15s，以完成细胞裂解并剪切DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。（注意为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至合适的频率与功率，将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行水浴超声。超声循环设置如下：超声3s，暂停10s，重复3-5次）。

4、超声处理后将样品置于冰上孵育30min。

5、将上述裂解样品，于4℃，12000rpm，离心15-20min，取上清到一个新的EP管，置于冰上备用。

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